数字PCR之:染料法介绍

数字PCR系采用终点法对PCR扩增的结果进行测量。为了检测结果的变化,这个时候需要一种额外的物质指标--荧光来对结果进行测量判读。一般来说有两种荧光检测指标:探针法和染料法。探针法是当探针结合到目标序列上以后,聚合酶降解探针后,探针上自带的荧光基团离开淬灭基团,从而发出荧光。探针法的优点是特异性好,但是其合成价格相对较高。


染料法一般使用的是Evagreen染料,这是一种可以与双链DNA小沟结合的荧光染料。Evagreen不会与单链DNA结合,且在失活状态下无荧光,只有与双链DNA结合才激活并发出荧光。因此将PCR扩增产生的双链DNA数量与荧光强度直接关联,产生终点法检测的效果。




Bruijns et al.(10.1016/j.ab.2016.07.022)曾比对了多种菁荧光团的染料荧光,发现Evagreen在低浓度的双链DNA检测中,具有极佳的检测线性。Evagreen对ssDNA结合力很低,保证了更高的信噪比。而且EvagreenPCR反应的抑制更小,因此在实验中可以使用较高浓度,提高亮度的同时也消除了“染料重新分布”;Evagreen染料法还可以通过改变扩增产物的长度,或者调整引物的量等条件,实现多重数字PCR反应。



Evagreen染料法的实验设计及检测流程 






实验结果分享:ddPCR染料法实验结果 


该实验是在某高校中心实验室里面使用达普星云数字PCR来对某基因进行定量检测,稀释了5个浓度梯度及阴性对照。结果显示,在5个浓度梯度下,检测结果符合预期,R2线性结果好。值得一提的是,数字PCR使用染料法操作简单方便,使用成本低。而且具有很高的检测灵敏度和优秀的重复性,反应检测限可低至0.5cp/μl。







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